Cap1tulo 1HISTORIA DE LA MICROBIOLOG2APedro Brevis Az3car1.1. Anton van LeeuwenhoekLas bacterias fueron descubiertas por Anton Van Leeuwenhoek en 1683 usando un microscopio de lente simple dise4ado por 5l mismo. En 16746 a partir de agua de lluvia e infusiones de pimienta7 observ8 por primera vez a los 9anim10culos11 que hoy reconocemos como protozoos y bacterias. M12s tarde13 encontr14 estos seres microsc15picos en las bocas humanas y en excrementos. En una carta del 17 de septiembre de 1683 enviada a la revista 16Philosophical Transactions of the Royal Society17 acompa1819 la descripci20n de los anim21culos encontrados en la saliva con unos dibujos que representaban algunos tipos de bacterias. Figura 1.1. Anton van Leeuwenhoek 221632-172323 y su microscopio.Alrededor del a24o 1700 era conocida la existencia de los microorganismos25 pero los microscopios de esa 26poca eran muy rudimentarios y no permit27an conocer con mayor detalle estos microbios. No exist28an m29todos adecuados para su cultivo y aislamiento30 por lo que durante los 200 a31os posteriores al descubrimiento de Leeuwenhoek32 el conocimiento referente a estos seres progres33 lentamente.34 13 35Historia de la Microbiolog36aLos problemas que interesaban a los investigadores de esa 37poca eran38a39 El origen de los microbios y la discusi40n de la teor41a de la generaci42n espont43nea.b44 La relaci45n de los microbios con la fermentaci46n y la putrefacci47n. c48 La relaci49n entre los microbios y las enfermedades.Antes de los descubrimientos de Leeuwenhoek50 los antiguos cient51ficos acu52aron una idea del origen de la vida denominada teor53a de la generaci54n espont55nea56 la que se remonta a la cultura griega. Arist57teles y otros fil58sofos hab59an ense60ado que las formas de vida se desarrollaban a partir de materia no viva61 esta creencia se generaliz62 durante la Edad Media. Uno de los m63s f64rreos defensores de la generaci65n espont66nea fue John Needham67 quien realiz68 una serie de experimentos tendientes a comprobar experimentalmente esta teor69a. En 176970 Lazzaro Spallanzani71 contradijo dicha teor72a73 pero no logr74 convencer a los investigadores de la 75poca.Figura 1.2. Lazzaro Spallanzani 761729-179977.1.2. Louis PasteurFinalmente78 la teor79a de la generaci80n espont81nea fue derribada por Louis Pasteur 821822-18958384 cient85fico y microbi86logo franc87s 88Figura 1.38990 utilizando para ello los microorganismos. Sus experimentos con los frascos de 91cuello de cisne92 le permitieron establecer que los microorganismos no se generan espont93neamente sino que siempre se originan mediante la reproducci94n de otros seres vivos semejantes a ellos mismos 95Figura 1.496. Adem97s98 entre muchos otros notables experimentos99 Pasteur demostr100 la naturaleza microbiana de la fermentaci101n l102ctica 1031857104105 fermentaci106n alcoh107lica1081861-1876109110 fermentaci111n but112rica 1131860114 y el car115cter anaerobio de sus agentes. 116 14 117Figura 1.3. Louis Pasteur 1181822-1895119.Figura 1.4. Experimento de Pasteur con frascos de 120cuello de cisne121.122 15 123Historia de la Microbiolog124aEsta verdad fue demostrada nuevamente en 1876-1877 con el trabajo de John Tyndall 1251820-1893126127 f128sico ingl129s cuyos estudios dieron la prueba final para refutar la antigua teor130a de la generaci131n espont132nea 133Figura 1.5134. Figura 1.5. John Tyndall 1351820-1893136.1.3. Robert KochLa edad de oro de la bacteriolog137a empieza despu138s de 1870 y contin139a durante todo el 140ltimo cuarto de siglo. Su comienzo coincide con la intervenci141n de Pasteur y de otro microbi142logo143 Robert Koch 1441843-1910145. Koch era m146dico rural de origen alem147n. Ten148a treinta y tres a149os cuando public150 en 1876 una memoria que inmediatamente lo colocar151a en primera l152nea entre los microbi153logos. En este trabajo154 demostr155 que el 156bacteridio de Davaine157 hoy denominado Bacillus anthracis era el agente del carbunco 158Figura 1.6159.Figura 1.6. Roberto Koch 1601843- 1910161.162 16 163Koch estableci164 las bases metodol165gicas de la bacteriolog166a m167dica. En su famosa memoria se enunciaban las reglas conocidas desde entonces con el nombre de 168postulados de Koch169. De este modo170 para demostrar que un determinado microorganismo es la causa de una enfermedad era necesario que el agente etiol171gico cumpliera con los siguientes postulados1721. El microorganismo debe estar presente en todos los casos de la enfermedad.2. El microorganismo debe ser aislado del hospedador enfermo y obtenerse en cultivo puro en el laboratorio.3. La enfermedad espec173fica debe reproducirse cuando un cultivo puro del microorganismo se inocula a un hospedador susceptible sano.4. El microorganismo debe ser recuperable de nuevo a partir del hospedador inyectado experimentalmente.Hasta entonces174 la bacteriolog175a contaba para su estudio solo con t176cnicas rudimentarias. Es a Koch y a sus colaboradores a qui177nes se les reconoce el haber ideado y perfeccionado las t178cnicas de aislamiento e identificaci179n bacteriana180 que constituyen las bases de la metodolog181a bacteriol182gica actual.El m183todo de aislamiento en medio s184lido lo emple185 Koch en 1881. Para obtener un cultivo puro utiliz186 placas de gelatinas o suero sangu187neo coagulado. Sobre este medio de cultivo aisl188 el bacilo tuberculoso. En 1882 utiliz189 agar-agar como agente solidificante190 el cual le fue sugerido por Fanny Hesse191 esposa de uno de sus colaboradores192 a quien le hab193an enviado esta sustancia para confeccionar jaleas y confituras. En 1887 un ayudante de Koch194 Julius Richard Petri invent195 una caja de vidrio redonda y plana que lleva su nombre y que permiti196 realizar m197todos de aislamiento y cultivos bacterianos.1.4. Christian GramAl mismo tiempo198 las t199cnicas de coloraci200n de las bacterias se desarrollaron con rapidez gracias al descubrimiento de los derivados de la anilina. Un alumno de Koch201 el dan202s Christian Gram invent203 en 1884 el m204todo de coloraci205n diferencial denominada tinci206n de Gram. As207 las bacterias que se ti208en de rojo se denominan gramnegativo y las de azul grampositivo 209Figura 1.7210. 211 17 212Historia de la Microbiolog213aFigura 1.7. Christian Gram 2141853 -1928215.Por otra216 parte Koch introdujo en 1882 la t217cnica de fijar los organismos por calor y con alcohol antes de te218ir219 logr220ndose las primeras tinciones de flagelos bacterianos. Ziehl y Nielsen inventaron la t221cnica especial de tinci222n de bacilo tuberculoso y de otras bacterias denominadas acidorresistentes. La aplicaci223n de estos m224todos facilit225 la identificaci226n de numerosos agentes causales de enfermedades infecciosas de origen bacteriano 227Tabla 1.1228.229 18 230Tabla 1.1.Resumen cronol231gico del desarrollo de las t232cnicas bacteriol233gicas y del aislamiento de las principales bacterias pat234genasA235o Autor 1850 Casimir Davaine 1874 Gerhard Hansen 1875 Robert Koch 1877 Robert Koch 1879 Albert Neisser 1880 Karl Eberth 1881 Robert Koch 1882 Frau Hesse 1882 Robert Koch 1883 Robert Koch 1884 Christian Gram 1884 Friedrich Loeffler 1884 Friedrich Rosenbach 1885 Theodore Escherich 1886 Albert Fraenkel 1886 David Bruce 1887 Julius Petri 1887 Anton Wichselbaum 1889 Kitasato Shibasabur236 1891 Max Wolff237 James Israel 1894 Kitasato Shibasabur238239 Alexandre Yersin 1897 Emile Ermergem 1898 Kiyoshi Shiga 1905 Fritz Schaudinn240Erich Hoffmann 1906 Jules Bordet241 Octave Gengou 1908 Paul Erlich 1910 Howard Ricketts 1926 Patrick Murray 1929 Alexander Fleming 1977 Charles Sherland242Joseph McDade AporteBacillus anthracisMycobacterium lepraeTrabajos sobre el bacilo del carbunco243Bacillus anthracis244T245cnicas de fijaci246n y coloraci247n de bacteriasNeisseria gonorrhoeaeSalmonella typhiT248cnicas de aislamiento en medio s249lido250gelatina251Utilizaci252n de agar-agar como medio solidificanteMycobacterium tuberculosisVibrio choleraeTinci253n de GramCorynebacterium diphtheriaeStaphylococcus254 StreptococcusEscherichia coli Streptococcus pneumoniae BrucellaInvento de la 255placa de Petri256Neisseria meningitidis Clostridium tetaniAgentes de actinomicosisClostridium perfringensClostridium botulinumShigella dysenteriaeTreponema pallidumBordetella pertussisCrea los primeros quimioter257picosRickettsias del tifus exantem258tico ListeriaDescubre la penicilinaLegionella pneumophila259 19 260Historia de la Microbiolog261aCap262tulo 2Origen de la vida microbianaCarlos Padilla EspinozaCap263tulo 2ORIGEN DE LA VIDA MICROBIANACarlos Padilla Espinoza2.1. Historia de la vidaLas preguntas fundamentales en evoluci264n permanecen inexploradas y consecuentemente no se encuentran todas las respuestas que el ser humano requiere. No se conocen las fuerzas que llevan a la evoluci265n de los organismos en una direcci266n y a267n es una materia de controversia en evoluci268n biol269gica. De modo elemental270 la intuici271n sugiere que la evoluci272n se ha movido desde la simplicidad a la complejidad. Los evolucionistas273 durante mucho tiempo274 han considerado que la historia de la vida debe remontarse al origen del universo275 donde el sistema solar y la Tierra poseen una antig276edad de aproximadamente 4.600 millones de a277os. En los or278genes de la formaci279n de nuestro planeta la superficie terrestre era extraordinariamente irregular280 incandescente y en general281 las condiciones fisicoqu282micas propicias para entender la vida no exist283an. Eso s284285 en esa superficie ya se encontraban una serie de elementos necesarios para crear vida. A medida que los milenios fueron transcurriendo286 diversas transformaciones fueron ocurriendo en la corteza terrestre. En general287 en una Tierra solidificada se produjeron lluvias que fueron enfri288ndola parcialmente y originando289 probablemente en algunas 290reas291 peque292os y grandes estanques con l293quidos que no eran necesariamente agua294 sino mezclas de amon295aco296 metano297 298cidos y diversas sales en suspensi299n acuosa.La radiaci300n solar301 sin la presencia de ozono302 impactaba libremente sobre los diversos complejos de productos qu303micos que comenzaban a interactuar entre s304. As305306 la radiaci307n ultravioleta y la descarga de rayos lograron la formaci308n de mol309culas mucho m310s grandes y complejas311 cuya creaci312n era totalmente azarosa. Muchas de estas nuevas mol313culas desaparec314an y otras perduraban manteni315ndose a trav316s de los a317os.Se piensa que un ambiente acu318tico y posterior a millones de ensayosespont319neos320 apareci321 una mol322cula capaz de autorreplicarse. Los actuales estudios323 324 21 325Origen de la vida microbianae hip326tesis que los acompa327an328 estiman que esta mol329cula fue el ARN330 el cual obtuvo la capacidad autorreplicante al ser incorporado en una estructura de mayor tama331o similar a un liposoma. Con el devenir de los milenios332 este ARN gener333 capacidades autocatal334ticas que permitieron la formaci335n de una nueva mol336cula con propiedades similares al ADN. Se piensa que estas complejas macromol337culas prebi338ticas fueron capaces de ganar mayor complejidad y generar las primeras c339lulas microsc340picas. De este modo341 estas c342lulas primigenias se situaron en un ambiente acu343tico344 donde abundaban sales minerales345 346cido sulfh347drico 348H2S349350 N2351 mientras que la atm352sfera primordial contaba con trazas de O2353 N2354 H2S y CO2355 adem356s de vapor de agua. Por otra parte357 en una atm358sfera carente de ozono la radiaci359n ultravioleta pasaba libremente. Este efecto f360sico incid361a sobre estas primeras formas de vida produciendo una enorme cantidad de mutaciones que causaban la muerte a trillones de estas c362lulas primitivas. Algunas de estas mutaciones fueron beneficiosas porque permit363an una mejor adaptaci364n de estos organismos ancestrales a este competitivo nuevo h365bitat. Lo m366s probable es que las c367lulas sobrevivientes hayan sido las que continuaron el proceso evolutivo368 particularmente cuando fueron capaces de asociarse en peque369os consorcios e iniciaron la s370ntesis de importantes cantidades de ox371geno que fluyeron a la atm372sfera373 gener374ndose una tenue capa de ozono. En los ambientes acu375ticos376 la vida ya hab377a iniciado los cambios absolutos que les permitieron a estas c378lulas primitivas utilizar el ox379geno y con ello obtener mayor cantidad de energ380a381 as382 el crecimiento celular alcanz383 altas velocidades. De esta forma384 surgieron los diversos tipos tr385ficos y moleculares que finalmente derivaron en la aparici386n de una c387lula de mayor complejidad denominada eucariota 388eu389 verdadero390391 en contraposici392n a los procariotas ancestrales 393pro394 antes395. En la Figura 2.1 se observa el proceso evolutivo a partir de 3000 millones de a396os donde probablemente exist397an peque398as organismos unicelulares esf399ricos400 anaerobios estrictos y que401 en carencia de ozono eran impactados por la potente radiaci402n ultravioleta. En cada etapa se observan los cambios f403sicos y qu404micos que se producen en la atm405sfera406 agua y tierra407 as408 como las modificaciones evolutivas de las c409lulas primigenias410 las que probablemente pasaron desde una fotos411ntesis anaer412bica a una fotos413ntesis aer414bica y metabolismo respiratorio415 hasta alcanzar la complejidad de una c416lula eucariota.417 22 418Figura 2.1. El origen de la vida distribuido desde los 3.000 millones de a419os hasta la aparici420n de las c421lulas eucariotas. Se observa el cambio atmosf422rico desde la ausencia hasta la presencia de ox423geno y formaci424n de la capa de ozono. Al mismo tiempo425 se evidencia que las c426lulas primigenias procariotas individuales se agrupan hasta la aparici427n de las eucariotas m428s complejas.2.2. Los estromatolitosDatos m429s concretos respecto de la antig430edad de estas c431lulas microsc432picas primitivas se hicieron evidentes posteriormente del descubrimiento de rocas sedimentarias fosilizadas433 principalmente conformadas por l434minas de carbonato de calcio denominadas estromatolitos 435Figura 2.2436. Los estromatolitos guardaban entre sus l437minas formas ancestrales microsc438picas de morfolog439a similar a las actuales bacterias. Lo sorprendente es que estas rocas presentaban antig440edades que sobrepasaban los 3.000 millones de a441os. Para llegar a esta conclusi442n443 los investigadores de f444siles primitivos fueron capaces de fechar su antig445edad a trav446s de la descomposici447n de is448topos radiactivos como el carbono 14 449C14450451 que al medirse entregar452 la data del f453sil incrustado en las unidades litol454gicas. Elso Sterrenberg Barghoorn455 paleont456logo norteamericano457 en 1954 realiz458 cortes en estromatolitos de 3.500 millones de a459os de 460 23 461Origen de la vida microbianaantig462edad463 descubriendo morfolog464as similares a las de los procariotes existentes. De esta forma465 el ser humano dispone de informaci466n que demuestra que los seres vivos m467s antiguos son de caracter468sticas unicelulares similares a las de los actuales procariontes. Figura 2.2. Estromatolito fosilizado donde se observan las diferentes capas de carbonato de calcio y en las que se encontraban incrustados microorganismos ancestrales. Obtenido y modificado de la p469gina http470471472www.solociencia.com473arqueologia47406122704.htm2.3. Teor475a Endosimbi476ticaEl continuo proceso evolutivo llev477 m478s tarde a la aparici479n de una c480lula de mayor tama481o y complejidad citoplasm482tica483 hoy denominada c484lula eucariota. Actualmente485 se pretende explicar la gestaci486n de esta nueva c487lula mediante la teor488a endosimbi489tica postulada por la cient490fica Lynn Margulis. Esta teor491a se fundamenta en que una c492lula ancestral de mayor tama493o494 probablemente sin pared celular495 fagocit496a una c497lula de metabolismo aer498bico499 que posiblemente evolucion500 internamente hacia lo que hoy conocemos como mitocondria. Ambas c501lulas en estado simbi502tico503 derivaron hasta la generaci504n del mundo animal. Adem505s de este evento inicial506 esta c507lula de mayor tama508o509 tambi510n fagocit511 una c512lula procariota fotosint513tica la que luego evolucion514 hacia un cloroplasto515 dando lugar a la c516lula vegetal 517Figura 2.3518. Si bien esta teor519a explica varios elementos fundamentales para comprender esta etapa del proceso evolutivo520 carece de informaci521n para entender la conformaci522n de los otros elementos citoplasm523ticos que contribuyen con la complejidad del citoplasma de una c524lula eucariota.525 24 526Figura 2.3. Proceso evolutivo en el que una c527lula eucariota fagocita a una bacteria heterotr528fica529 la cual se transforma en mitocondria530 divergiendo hacia una c531lula animal. Esta misma c532lula533 posteriormente534 fagocita a una bacteria autotr535fica generadora de ox536geno537 la cual se transforma en cloroplasto538 dando origen al mundo vegetal. 2.4. ArchibacteriasDurante el a539o 1982540 Carl Woese demostr541 a la comunidad cient542fica interesada543 que para resolver el origen de la vida ya no deb544a investigar solo en los restos fosilizados de estromatolitos. Woese postul545 que en los 546cidos nucleicos de las actuales c547lulas est548 la informaci549n que permite remontarnos a los or550genes de la vida. El estudio del ARNr 16S551 aislado desde microorganismos de ambientes ex552ticos553 anaerobios estrictos554 metan555genos556 tolerantes a altas concentraciones de sal y que viven a temperaturas cercanas a los 100 557C y pH menor a 2558 le permiti559 a este investigador definir una nueva forma de vida560 que en t561rminos geneal562gicos563 no era eucariota ni bacteria. Estos microorganismos de morfolog564a y tama565o similar a las actuales bacterias fueron denominados archibacterias o arqueobacterias. Desde una perspectiva fenot566pica se pueden diferenciar tres grupos de archibacterias567 568 25 569Origen de la vida microbianaLas metan570genas producen metano 571CH4572 como producto metab573lico. Se encuentran en lugares con abundante material en descomposici574n como fuentes termales y fondos marinos. Un g575nero de archibacterias de este grupo es Mathanospirillum. En el otro grupo se encuentran las hal576filas577 que habitan lugares con gran concentraci578n salina579 confiri580ndole un color rosado a las aguas saturadas de sal. Un g581nero representante de este grupo es Halobacterium. Las archibacterias termoacid582filas habitan lugares donde el pH es 1 o 2 y la temperatura est583 sobre los 90 584C. Un representante de este grupo es Sulfolobus. Este descubrimiento significa que no existen dos l585neas de descendencia evolutiva de los seres vivos586 sino tres587 archibacterias588 bacterias y eucariotas589 conformando los denominados tres grandes dominios de la vida590 Bacteria591 Archaea y Eucarya592 que se sit593an por sobre del concepto Reino.594 26 595Cap596tulo 3Ordenamiento de bacteriasCarlos Padilla EspinozaCap597tulo 3ORDENAMIENTO DE BACTERIASCarlos Padilla Espinoza3.1. Ordenamiento de los seres vivosEl ordenamiento de los seres vivos ha sido fundamental para iniciar el estudio de ellos. Es as598 que las bacterias al igual que los dem599s organismos vivos se clasifican en g600neros y especies seg601n el diagrama bin602mico propuesto por Carlos Linneo. Su denominaci603n se hace en lat604n y su escritura se realiza en letra cursiva como por ej. Pseudomonas aeruginosa605 donde en primer lugar se rese606a el g607nero en may608scula y a continuaci609n la designaci610n de especie en min611scula. En apariencia esta f612rmula es sencilla613 pero basta realizar un par de razonamientos para evidenciar que tras ella existe una enorme complejidad. A diferencia de los seres superiores las bacterias no presentan diferenciadores morfol614gicos importantes y los antecedentes de f615siles microbianos son escasos si se considera la enorme amplitud de esta forma de vida. Esto se entiende mejor al no existir una descripci616n detallada que d617 cuenta del proceso evolutivo de las formas m618s antiguas de las bacterias. En segundo lugar619 se debe considerar que las bacterias sufren diferentes tipos moleculares de mutaciones y procesos de transferencia gen620tica que producen grandes cambios capaces de modificar elementos estructurales y fisiol621gicos de las mismas.3.2. Agrupaciones de los seres vivosComo una forma de destacar los principales hitos de la taxonom622a bacteriana623 es importante citar al zo624logo alem625n Ernst Heinrich Haeckel 6261866627 que propuso que628 adem629s del Reino Animal y del Reino Vegetal630 deb631a existir un tercer Reino que comprendiera los organismos unicelulares. A este nuevo Reino lo llam632 Protista. Su propuesta tambi633n fue denominada como la clasificaci634n de tres reinos. En general635 el Reino Protista agrupaba a las bacterias636 hongos637 algas y protozoos. 638Figura 3.1639. Esta es probablemente la primera clasificaci640n donde se le da un trato taxon641mico interesante a las bacterias. M642s tarde643 Edouard Chatton 6441932645 dividi646 a las 647 28 648Ordenamiento de bacteriasProtistas en Protistas superiores 649Algas pardas y rojas650 Hongos651 Protozoos652 y Protistas inferiores 653Bacterias y algas verde azules654 actuales cianobacterias655. Figura 3.1. La primera clasificaci656n con base cient657fica fue propuesta por Ernest Haeckel en 1866 donde se inclu658an al Reino de las Plantas659 Animales y Protista en el que se incorporaba a las bacterias660 algas661 hongos y determinados protozoos. Se observa la propuesta original del autor. Obtenido de http662663664blogcienciaalavista.blogspot.cl665200966604667la-clasificacion-de-los-seres-vivos.html.668 29 669Posteriormente670 en 1969671 Robert Whittaker672 realiza una clasificaci673n basada en los tipos de nutrici674n 675fotos676ntesis677 absorci678n e ingesti679n680681 tipo celular y nivel de organizaci682n683 considerando la existencia de 5 Reinos684 Monera685 que incluye a las bacterias y cianobacterias686 Protista687 que agrupa a microalgas y protozoos688 Hongos689 que incorpora a hongos uni y pluricelulares690 Vegetal que incluye a plantas verdes pluricelulares y algas superiores691 y finalmente el reino Animal que considera a los animales multicelulares. Figura 3.2. Clasificaci692n de cinco reinos propuesta por Robert Whittaker693 fundamentada en la diferenciaci694n celular y los tipos de nutrici695n que presentan los seres vivos. En la base se sit696a el Reino Monera 697698nicos procariontes699700 para dar paso a Protista701 Hongos702 Plantas y Animales.Carl Woese bas703ndose en sus estudios moleculares con ARN 16S propuso la creaci704n de un 705rbol Filogen706tico Universal que se compone de tres Dominios distribuidos en tres l707neas Bacteria708 Archaea y Eukarya 709Figura 3.3710 Tabla 3.1711. En este contexto712 hoy existen dos l713neas muy diferentes de procariotas Bacteria y Archaea. Si bien estas l714neas celulares se parecen morfol715gicamente716 difieren en sus aspectos moleculares717 tales como que las bacterias poseen 718cido mur719mico como parte constituyente del peptidoglic720n 721 30 722Ordenamiento de bacteriasy sus l723pidos de la membrana presentan 724cidos grasos de cadena recta con enlaces 725ster726 en cambio727 las archibacterias no poseen 728cido mur729mico en su pared y sus 730cidos grasos de membrana poseen cadenas alif731ticas ramificadas. Se destaca que entre estas dos l732neas de vida existen muchas otras diferencias y a su vez que entre estas y la l733nea Eucarya existen diferencias y similitudes moleculares. Actualmente734 se acepta la presencia de 7 Reinos sugeridos por Ruggiero el a735o 2015736 los que se agrupan en dos superreinos737 el Prokaryota y el Eukaryota. El superreino Procaryota considera al Reino Bacteria738 conformado por microorganismos procariotas y al Reino Archaea739 que incorpora a procariotas con composici740n de l741pidos de membrana diferentes al de las bacterias. El superreino Eukaryota742 incluye al Reino Plantae743 compuesto por organismos pluricelulares fotosint744ticos eucariotas y pared celular de celulosa745 Reino Animalia746 formado por organismos eucariotas pluricelulares heterotr747ficos748 Reino Protozoa749 al que se incorporan organismos eucariotas microsc750picos 751 unicelulares y heterotr752ficos753 Reino Fungi754 al que se asocian organismos eucariotas uni y pluricelulares que presentan pared con quitina755 Reino Chromista al que pertenecen organismos eucariotas uni y pluricelulares muy variados756 con y sin capacidad fotosint757tica.Figura 3.3. De los estudios efectuados por Carl Woese se concluye la descripci758n de los tres grandes Dominios universales que se encuentran por sobre la categor759a de Reino y constituyen el 760rbol filogen761tico de la vida. Obtenido y modificado de762 Woese C. R. 2000. Interpreting the universal phylogenetic tree. Proc Natl Acad Sci. USA. 97 76315764 8392-8396.765 31 766Tabla 3.1.Principales caracter767sticas diferenciales entre los tres grandes dominios de la vidaCaracter768sticas Estructura celular procariota ADN circular N769cleo rodeado de membrana Pared celular L770pidos de membrana 771cidos grasos de membrana Ribosomas Iniciador ARNt Intrones en genes de ARNt Operones Plasmidios Sensibilidad a772 cloranfenicol y estreptomicina Metanog773nesis Nitrificaci774n Bacteria Si Si No Mure775na 776ster Lineal 70S Formil Metionina No Si Si Si No Si Archaea EucaryaSi NoSi NoNo No mure777na 778ter Ramificados 70S Metionina Si Si Si No Si No SiNo mure779na780sterLineal80S y 70SMetioninaSiNoRaroNoNoNo3.3. Taxonom781a bacterianaLa ciencia taxon782mica se refiere a la clasificaci783n biol784gica y comprende tres sub785reas786 clasificaci787n788 nomenclatura e identificaci789n. La clasificaci790n es la organizaci791n estructurada de los seres vivos en grupos tambi792n llamados taxones o rangos. Lo anterior en relaci793n con sus semejanzas o parentesco evolutivo. La nomenclatura se refiere al otorgamiento de los nombres oficiales a grupos o individuos en concordancia con la normativa oficial y aceptada por la comunidad cient794fica. Lo anterior795 se encuentra particularmente regulado por el International Committee on Systematic and Evolutionary Bacteriology796 mediante el International Code on Nomenclature of Bacteria. Las aprobaciones de denominaciones bacterianas son publicadas y actualizadas en el International Journal of Systematic Bacteriology. La identificaci797n da cuenta del aspecto pr798ctico del proceso taxon799mico y consiste en la asignaci800n de un microorganismo a un grupo o tax801n802 mediante el uso de diferentes metodolog803as de laboratorio. Es com804n emplear el t805rmino sistem806tica en reemplazo de taxonom807a808 pero este es un t809rmino m810s amplio que involucra el estudio cient811fico de los organismos812 cuyo objetivo final es caracterizarlos y agruparlos en forma ordenada.Desde sus inicios la taxonom813a bacteriana cl814sica ha utilizado aspectos morfol815gicos con 816nfasis en la forma817 agrupaci818n de las c819lulas bacterianas820 tama821o y afinidad tintorial al Gram822 movilidad mediante la tinci823n flagelar824 con 825nfasis en n826mero y disposici827n de los flagelos828 aspectos nutritivos y fisiol829gicos remarcando aspectos de conservaci830n de energ831a 832fot833trofo834 quimiorganotr835fico836 quimiolitotr837fico838839 su relaci840n con el ox841geno 842aerobio estricto843 anaerobio estricto844 facultativo845846 tolerancia a la sal847 y principalmente su capacidad para tolerar o metabolizar diferentes fuentes de 848 32 849Ordenamiento de bacteriascarbono850 nitr851geno y azufre. A lo anterior852 se le han adicionado otros factores tales como susceptibilidad a los antibacterianos853 presencia de pigmentos854 capacidad patog855nica856 entre otros. A este tipo de taxonom857a tambi858n se le denomina taxonom859a fenot860pica861 la cual ha sido utilizada desde los inicios de la bacteriolog862a m863dica864 realizando una importante contribuci865n en la identificaci866n bacteriana asociada al diagn867stico de enfermedades infecciosas. Las pruebas se868aladas anteriormente presentan diferentes grados de importancia en el proceso de identificaci869n. Es as870 que las propiedades morfol871gicas y de agrupaci872n son pruebas iniciales y provisorias en comparaci873n a las de fermentaci874n o actividad enzim875tica. De esta forma876 las pruebas bioqu877micas permiten identificar con alto grado de certeza878 bacterias que son cl879nicamente importantes 880Figura 3.4881. A estas determinaciones tambi882n se les denomina identificaci883n del biotipo.Figura 3.4. Identificaci884n fenot885pica de bacterias fundamentada en la utilizaci886n bioqu887mica de determinados sustratos 888API Test 20889. Cada galer890a considera el estudio de 20 sustratos diferentes. Los resultados obtenidos de las pruebas bioqu891micas son comparados frente a modelos estandarizados que conducir892n a la identificaci893n.La utilizaci894n de un n895mero importante de pruebas fenot896picas otorga mayores probabilidades para una mejor identificaci897n bacteriana. La Taxonom898a Num899ricaconsiste en una mirada cuantitativa a la ciencia taxon900mica901 que con la ayuda de computadores ha permitido procesar grandes n902meros de pruebas. El resultado de la clasificaci903n final se basa en la semejanza de los caracteres fenot904picos estudiados. Una vez finalizada esta tarea se determina para cada uno de los microorganismos estudiados un coeficiente de asociaci905n que va de 0.0 a 1.0 906menor a mayor asociaci907n908. Posteriormente909 las bacterias se ordenan en una matriz de semejanza. Finalmente910 estos resultados se disponen en una figura similar a un 911rbol denominado dendrograma. 912 33 913DendrogramaEn esta figura se establecen los porcentajes de semejanza que permitir914n discernir entre las bacterias que se asocian a nivel de especie915 g916nero o familia. Un porcentaje de semejanza sobre 80 917 puede significar un parentesco a nivel de especie. El m918todo de la taxonom919a num920rica tambi921n es 922til para comparar secuencias de 923cidos nucleicos y prote924nas de origen bacteriano 925Figura 3.5926. A BFigura 3.5. A927 Gel de agarosa de un RAPD-PCR928 con partidores arbitrarios en los cuales se evidencian diferentes polimorfismos gen929ticos. B930 Dendrograma obtenido a partir de los productos de RAPD-PCR y ordenados utilizando el programa Taxotron931 software de an932lisis num933rico que da como resultado la aparici934n de dos grupos de bacterias relacionados gen935ticamente 936B1 y B2937.938RAPD-PCR939 940Random Amplification of Polymorphic DNA941. La t942cnica RAPD-PCR consiste en la amplificaci943n enzim944tica de fragmentos de ADN945 utilizando cebadores de secuencia arbitraria que hibridan en loci repartidos aleatoriamente en todo el genoma. Ello revela la existencia de polimorfismos que son utilizables como marcadores gen946ticos y taxon947micos en todo tipo de organismos. Polimorfismos gen948ticos949 son las variaciones naturales en un gen950 secuencia de ADN951 o cromosoma.3.4. Herramientas de identificaci952n bacterianaIdentificaci953n inmunol954gica La identificaci955n inmunol956gica o serol957gica es un ensayo que permite distinguir el serotipo. Esta propiedad se fundamenta en que las bacterias poseen diversas estructuras altamente inmunog958nicas que se pueden identificar mediante sus correspondientes anticuerpos espec959ficos. Este tipo de identificaci960n es relevante en bacterias de significancia cl961nica962 las que pueden resultar inertes frente a determinadas 963 34 964Ordenamiento de bacteriasmacromol965culas usadas corrientemente en la identificaci966n bacteriana 967ej. Francisella968 Bordetella969. Tambi970n para otras bacterias pat971genas dif972ciles de cultivar 973ej. Treponema974 Mycoplasma975 y adem976s en variedades de alguna especie que necesariamente deban ser puestas en evidencia 977ej. E. coli enterohemorr978gica979 Shigella flexneri980. Una ventaja interesante de la identificaci981n inmunol982gica es la rapidez con la cual se puede realizar una identificaci983n al tomar directamente la colonia de la placa como ocurre con Streptococcus pyogenes. La serotipificaci984n de bacterias presenta una interesante importancia epidemiol985gica.Identificaci986n por fagotipiaLa fagotipia permite utilizar diferentes bacteri987fagos l988ticos sobre determinadas bacterias susceptibles. En este caso989 se aprovecha la capacidad de reconocimiento que presentan algunos fagos990 a receptores bacterianos altamente espec991ficos. Los procedimientos se evidencian utilizando siembras en c992sped de bacterias y posteriormente vertiendo sobre ellas diluciones de los fagos a estudiar mezcladas en un medio semis993lido. La evidencia de la acci994n l995tica espec996fica es la producci997n de placas de lisis998 que son peque999as zonas transparentes sobre el c1000sped bacteriano 1001Figura 3.61002. Figura 3.6. Placa de Petri con cultivo bacteriano sembrado en c1003sped y con diversas placas de lisis producto de la acci1004n de bacteri1005fagos. Obtenido de https100610071008www.mun.ca1009biology1010scarr10114241smc_Ecoli_1012_T2_bacteriophage.htmlIdentificaci1013n mediante bacteriocinasLas bacteriocinas son sustancias de naturaleza proteica elaboradas por diferentes g1014neros bacterianos que producen una actividad letal sobre otras bacterias. Presentan diferentes mecanismos de acci1015n y amplitud de espectro antibacteriano1016 lo que es controversial1017 considerando que diversos autores proponen un reducido espectro de acci1018n.Actualmente1019 han sido estudiadas con fines biotecnol1020gicos como la preservaci1021n de alimentos y control de bacterias pat1022genas para el ser humano y animales 1023Figura 3.71024. 1025 35 1026Figura 3.7. Cultivo bacteriano de una cepa blanco sembrada en c1027sped e inoculada con 10 1028l de bacteriocinas aisladas de diferentes cepas. Los halos inhibitorios demuestran la acci1029n letal de las bacteriocinas.Identificaci1030n mediante el antibiotipoLa susceptibilidad antibacteriana a diferentes antimicrobianos puede constituirse en una interesante herramienta a la hora de identificar cepas de especies bacterianas con fines epidemiol1031gicos. En este caso1032 el prop1033sito no es detectar la sensibilidad o resistencia de la cepa estudiada1034 sino que averiguar frente a un alto n1035mero de antimicrobianos cu1036l es su perfil de susceptibilidad. Para ello1037 se utiliza la prueba cualitativa de difusi1038n mediante sensidiscos. Mientras mayor el n1039mero de antimicrobianos analizados1040 mayores posibilidades de determinar el perfil de susceptibilidad1041 el que se utiliza para realizar las comparaciones entre las cepas las cuales pueden ser obtenidas1042 por ejemplo1043 desde alg1044n brote epid1045mico infeccioso.Identificaci1046n genot1047picaLa identificaci1048n bacteriana mediante la taxonom1049a molecular utiliza diferentes m1050todos que permiten una caracterizaci1051n bacteriana mucho m1052s fiable que la taxonom1053a fenot1054pica. A medida que se producen desarrollos metodol1055gicos con fundamento en biolog1056a molecular1057 estos han sido paulatinamente utilizados en identificaci1058n bacteriana. Entre los principales ensayos moleculares para la clasificaci1059n e identificaci1060n de bacterias se encuentran1061Composici1062n del porcentaje de G-C. En el mundo bacteriano1063 el porcentaje de guanina-citosina 1064G-C1065 var1066a entre un 25 y 75 1067. Se considera un car1068cter taxon1069mico que por s1070 mismo no contribuye a la identificaci1071n ni a la clasificaci1072n1073 ya que en general se produce una sobreposici1074n de estos valores en diferentes especies bacterianas. Asimismo1075 dos cepas con el mismo contenido G-C no tienen por qu1076 ser de la misma especie.Hibridaci1077n de 1078cidos nucleicos. Considera la posibilidad de que cadenas sencillas de ADN se asocien para formar d1079plex. En este caso1080 se mide la cantidad de ADN que finalmente es capaz de reconocerse y formar una doble hebra estable. Se estima que para que dos cepas tengan relaci1081n de parentesco deben asociar su ADN en m1082s del 70 1083.Secuenciaci1084n de 1085cidos nucleicos. Esta metodolog1086a presenta un valor importante en la clasificaci1087n1088 pero no en la identificaci1089n. Este m1090todo es el m1091s exacto porque se puede analizar el genoma completo de una bacteria y compararlo con el de otro microorganismo.1092 36 1093Ordenamiento de bacteriasOligonucle1094tidos del ARNr 16S. Esta mol1095cula de aproximadamente 1500 pares de bases se encuentra presente en los ribosomas de todas las c1096lulas procariotas. Su funci1097n y estructura se han mantenido invariables durante millones de a1098os y solamente se evidencian cambios muy peque1099os. Posterior a la obtenci1100n de la secuencia de nucle1101tidos del ARNr1102 se realiza un estudio comparativo entre las secuencias a estudiar1103 lo que permite analizar su grado de similitud. Si esto se efect1104a con los ARNr 16S de un par de bacterias1105 el resultado obtenido indicar1106 su relaci1107n evolutiva.Secuencia de oligonucle1108tidos firma 1109secuencias signatura1110. Se configuran por secuencias espec1111ficas cortas que est1112n presentes en todos los miembros de un tax1113n y nunca se encuentran en otros grupos1114 ni siquiera en aquellos m1115s cercanos. Esta ha sido la metodolog1116a m1117s utilizada durante el 1118ltimo tiempo para identificar bacterias patog1119nicas. Espec1120ficamente1121 se realiza la comparaci1122n de secuencias de ARNr 16S o bien de sus respectivos genes codificantes utilizando la reacci1123n de polimerasa en cadena 1124RPC1125. Normalmente1126 se utiliza el t1127rmino PCR1128 derivado del ingl1129s Polymerase Chain Reaction. Esta metodolog1130a ha causado un interesante impacto en taxonom1131a microbiana ya que permite una identificaci1132n confiable y r1133pida. En general1134 en bacteriolog1135a esta t1136cnica se emplea para identificar microorganismos de dif1137cil o lento crecimiento. Tambi1138n es posible realizar la identificaci1139n directamente de la muestra bacteriol1140gica cuando el agente causal de una infecci1141n bacteriana es parte de la misma1142 evitando con ello el cultivo y posterior identificaci1143n. Se considera que a medida que la tecnolog1144a tenga mayor desarrollo el valor econ1145mico de estas reacciones ser1146 m1147s competitivo y por lo tanto1148 accesible a los laboratorios de microbiolog1149a cl1150nica.Existe otra serie de procedimientos metodol1151gicos dirigidos a clasificar las bacterias a nivel de subespecie lo que representa un importante aporte a la epidemiolog1152a bacteriana. Entre estos se cuentan el an1153lisis de pl1154smidos1155 el ribotipado y an1156lisis de segmentos del ADN gen1157mico1158 entre otros.Identificaci1159n anal1160ticaDurante los 1161ltimos a1162os se han empezado a utilizar nuevas metodolog1163as en la identificaci1164n bacteriana. Esta nueva tecnolog1165a permite clasificar a las bacterias en g1166neros1167 especies y subespecies. Entre ellas destacan los estudios con micobacterias1168 donde los perfiles cromatogr1169ficos de los 1170cidos mic1171licos de sus paredes celulares permite una correcta identificaci1172n. La espectroscop1173a de masa ha sido utilizada para analizar prote1174nas bacterianas y permitir su diferenciaci1175n en subespecies. Hasta el momento estas nuevas t1176cnicas son de alto costo tanto por el equipamiento empleado como por el alto valor de los reactivos utilizados.3.5. Manual de BergeyBergey1177s Manual of Determinative Bacteriology es la obra que re1178ne la mayor cantidad de informaci1179n respecto de la taxonom1180a bacteriana. Su nombre es en honor a David Bergey1181 bacteri1182logo de la Universidad de Pensilvania1183 que junto a sus 1184 37 1185colaboradores en el a1186o 1923 public1187 una clasificaci1188n de bacterias que serv1189a para realizar una identificaci1190n de las mismas. Consecuente con el desarrollo de la tecnolog1191a y su aplicaci1192n a las metodolog1193as de identificaci1194n bacteriana1195 aparecieron a trav1196s de los a1197os nuevas ediciones que daban cuenta de nuevos grupos bacterianos. En estos momentos se encuentra a la venta la novena edici1198n de este libro que da cuenta de 35 grupos relacionados a cuatro categor1199as de microorganismos1200 tres de ellas correspondientes a bacterias y la 1201ltima a archibacterias.. Categor1202a I 1203grupos 1 al 161204 se encuentran las bacterias gramnegativo con pared celular1205 en la categor1206a II 1207grupos 17 al 291208 se encuentran las bacterias grampositivo con pared celular1209 en la categor1210a III 1211grupo 301212 se encuentran las bacterias carentes de pared celular 1213Mycoplasma1214 y en la categor1215a IV 1216grupo 31 al 351217 se encuentran las archibacterias.De acuerdo con lo descrito en este manual las categor1218as taxon1219micas son las siguientes1220 Dominio1221 Phylum1222 Clase 1223subclase12241225 Orden 1226suborden12271228 Familia 1229tribu12301231 G1232nero 1233subg1234nero12351236 Especie 1237subespecie1238.En este manual la unidad taxon1239mica b1240sica es la especie. La definici1241n de especie en bacteriolog1242a es un tema complejo y no superado. La definici1243n de especie en organismos superiores se refiere a grupos de poblaciones que se reproducen naturalmente entre s1244. Ello no ocurre en las c1245lulas procariotas debido a que no presentan reproducci1246n sexual. En este contexto una especie bacteriana seg1247n Stanley 1248 Kreig 124919841250 puede definirse como una colecci1251n de cepas que comparte muchas caracter1252sticas en com1253n y difiere considerablemente de otro grupo de cepas. El concepto de cepa puede defini

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