Molecular genetic engineering

Apuntes

Requisitos para la expresión génica en E. coli incluyen la integridad de la secuencia codificante, su colocación bajo un promotor reconocido por la RNA polimerasa de E. coli, la estabilidad del RNAm y la resistencia de la proteína a las proteasas del huésped. •RNA polimerasa de E. coli - Compuesta por subunidades alfa (rpoA), beta (rpoB), beta prima (rpoC), sigma (rpoD) y omega. - La subunidad sigma es esencial para el reconocimiento del promotor, aumentando la afinidad en más de 1000 veces. - Factores sigma (σ70, σ54, σ38, σ32, σ28, σ24, σ18) regulan diferentes fases y condiciones de estrés. •Transcripción en E. coli - La velocidad de síntesis de ARN es de aproximadamente 2400 nucleótidos/min a 37°C. - La RNA polimerasa I transcribe rRNA, la II mRNA y snRNA, y la III 5S rRNA y tRNA. - La transcripción en fagos es más rápida y requiere menos promotores. •Reconocimiento y localización de promotores - Se emplean técnicas como footprinting, mapeo S1, PCR (RACE) y plásmidos “promoter-probe”. - La secuencia típica incluye las cajas -35 (TTGACA) y -10 (TATAAT), separadas por 16-19 pb, donde inicia la transcripción. •Terminadores de transcripción - Rho-dependientes: ...